摘要在運用顯微鏡計數法進行白細胞計數的實驗教學中，容易出現一些問題，如技術誤差、固有誤差、儀器誤差等。經過多年的教學總結和仔細分析，得出一些相應的解決方法，以期共同探討。
關鍵詞中職檢驗專業；白細胞計數實驗；誤差
1引言
中職學校檢驗專業學生在進行白細胞計數實驗中，容易出現實驗器材使用不當、實驗操作不規範或對實驗理論知識不理解而導致實驗結果偏差甚至實驗過程受阻等；另外，即使一位技術熟練者，使用同一儀器在對同一標本進行連續多次操作，檢測結果也常有一定差異。本文提出白細胞計數實驗中容易出現的一些問題即技術誤差、固有誤差以及儀器誤差等進行分析探討且給出相應的解決方法，以盡力避免學生在實驗過程中出現的錯誤操作或無效操作，提高學生操作效率及能力，達到更好的教學效果。
2技術誤差
由於操作不正確或儀器不精確造成的誤差爲技術誤差。這類誤差通過主觀努力可以避免或降到最低程度[1]。採血部位不同結果產生偏差世界衛生組織（WHO）推薦採血部位以左手無名指或中指指尖的內側爲宜。在我國有些地方仍採用耳垂取血，耳垂部位痛感較輕且不易感染，但其血循環較差，受溫度變化影響較大，所以一般情況下采用手指部位取血。在學生實驗操作時，筆者將30名學生同時採指血和耳垂血，分別進行採血取樣進行對照。計數結果是耳垂血白細胞數高於手指血白細胞數的爲28例，約佔93.3%，平均數值增高1.9×109/L。白細胞數目的多少可能與所在採血部位的血管深淺、粗細、血流速度、血液粘滯度等多種因素有關。耳垂白細胞計數偏高的主要原因可能是耳垂體積小散熱快，所處環境溫度低，血流慢，血液粘滯度大，白細胞易於沉積。手指則不然，手指活動量大、體積大，溫度相對高，血流快，血液粘滯度小，白細胞不易沉積，所以這些可能是手指血白細胞計數偏低的主要原因[2]。計數板不清潔乾燥1）計數板的清潔方法。血細胞計數板使用後，取下蓋玻片，用自來水沖洗，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗後自行晾乾或用吹風機吹乾，也可用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮等有機溶劑脫水使其乾燥。另外，計數板沖洗後,還要通過鏡檢觀察每小格內是否殘留菌體或其他沉澱物。若不乾淨,則必須重複清洗直到乾淨爲止，乾燥後方可放入盒內保存或使用。2）計數板上殘存水滴，會使充液不均，還會造成混合液濃度降低[3]。
解決方法：將計數板置於清潔環境，自然乾燥或在空氣中快速揮動，如急用也可輕輕甩掉計數板上水滴後再用濾紙片將殘存水分吸乾。3）計數板上殘留纖維等雜質影響鏡下觀察清晰度。解決方法：用流動的清水洗淨計數板後再進行上述具體操作。微量吸管使用不當本實驗採用一種改進的微量吸管，屬於醫療器械技術領域。它由氣囊和與之管通的吸管一體構成，氣囊與吸管管通一端的底部具有孔，吸管上標有刻度，故可在採取樣液時利用指壓啓閉其孔實現準確性，該吸管具有造價低、精確度高、操作簡便靈活的特點，又具有可作爲一次性產品使用，能夠避免交叉感染等的優點。1）微量吸管折斷。解決方法：微量吸管細長易斷，在將其插入橡膠頭內時，應左手持橡膠頭（注意氣囊孔的控制），右手必須持住靠近微量吸管上端的部分輕輕操作，纔能有效防止其折斷。2）微量吸管取樣混有氣泡。解決方法：取樣時，需將微量吸管末端完全浸入血樣末端，輕輕抽吸，纔不會混入空氣。3）血樣進入橡膠頭。解決方法：取樣前應先捏緊橡膠頭，封閉氣孔，取樣時將橡膠頭慢慢地、一點一點地鬆開，如果鬆開速度過快或力度過大，就會發生上述現象[4]。取樣操作不規範以用一次性定量（20μl）微量吸管取末梢血爲例，
正確操作是：輕輕吸取末梢血到微量吸管第二個刻度線後再多取一點兒，此時右手捏穩橡膠頭不動，左手持幹棉球置於微量吸管管尖部位，右手輕捏橡膠頭擠出管內多餘血樣至剛好到吸管第二個刻度線爲止，此時再用左手的棉球將管尖外多餘血液擦掉。上述每一步驟缺一不可。充液不當1）充液量過少造成充液缺損，過多則造成蓋玻片懸浮，細胞飄忽不定。2）充液時玻棒位置不正確，造成充液缺損或有氣泡。正確操作是：用玻棒蘸取適量混懸液後應輕輕接觸蓋玻片一角，讓液體自動進入計數池並剛好充滿後立即移走玻棒。3）充液時間延遲。混懸液完成後應立即充液觀察計數，有實驗證明如果混懸液放置超過1.5分鐘以上在進行充液計數操作，會使計數結果偏低[5]。白細胞在剛剛混勻的液體中均勻分佈，而靜置超過1.5分鐘後白細胞會逐漸下沉，造成混懸液密度不均，在吸取上層液體充液進行計數時會產生偏差[5]。低倍鏡下看不到計數池1）瞭解計數板的構造。血球計數板是一塊特製的厚型載玻片，載玻片上有4個槽構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩個計數區，每個計數區上面各刻有一方格網，每個方格網共分9個大方格，4個角的大方格作爲白細胞計數用，每個大方格被單線劃分成16箇中方格；最中央大方格被雙線劃分成25箇中方格，而每個中方格又分成16個小方格，供計數密度較大的紅細胞計數時使用。每個計數區由400個小方格組成，計數區邊長爲1mm，則計數區的面積爲lmm2，每個小方格的面積爲1/400mm2。蓋上蓋玻片後，計數區的高度爲0.1mm，所以每個計數區的.體積爲0.1mm3，每個小方格的體積爲1/4000mm3。2）計數板放置位置不正確。
計數板有上下兩個相同的計數池，應將要觀察的、充好液的一側置於視野中央。3）光線過強。計數板放置好後，調整好焦距，如仍看不到計數池上的畫線，可能是光線過強的緣故，調整顯微鏡光圈或遮光鏡至視野較暗，再調整細準焦螺旋至視野清晰即可看到計數池上的畫線[6]。辨別不出計數池4個角大方格的位置，解決方法如下。1）先找到計數池內最中央的大方格，特點是橫線與豎線均爲雙線劃分的含有25箇中方格的大方格，也是線條最密集的大方格就是計數池內最中央的大方格。2）以最中央大方格爲標的，分別沿上、下、左、右方向移動計數板，找到外側兩邊爲單線、內側兩邊爲雙線的含16箇中方格的大方格即分別爲四個角上的大方格。顯微鏡下將雜質誤認爲白細胞1）粉塵顆粒。粉塵顆粒不具備細胞的基本形態，低倍鏡下白細胞呈圓形，細胞內有深色的核，上下微調細準焦螺旋白細胞具有折光性。2）氣泡。氣泡亦不具備細胞的基本形態，微調細準焦螺旋時鏡下顯現爲無細胞結構的空圈。漏數或重複計數1）每一個角上的大方格都被劃分爲16箇中方格，計數時應以中方格爲依據，按一定方向和順序計數，如從上到下、從左到右的順序。2）對壓線的白細胞應採取數上不數下、數左不數右的原則。
3固有誤差
由於因每次白細胞分佈不可能完全相同而造成的偏差叫固有誤差[1]。計數池內細胞分佈不均白細胞總數在正常參考範圍內時，若每個大方格的白細胞數值相差8個以上視爲細胞分佈嚴重不均，可能是混合液密度不均或充液不當，需輕輕搖勻混合液重新充液計數。根據統計學研究白細胞在技術池內的分佈符合Poison分佈。其變異係數CV=1/m，m代表計數池重複計數的白細胞均數。通過上式可以得出m越大，CV越小，所以計數範圍越大，計數細胞越多，計數域誤差越小。常規考覈標準學生計數完畢後，通常要用常規計算標準公式來評判實驗結果是否達標，否則要重新採血充液計數。即：RCS=（4個大方格所數白細胞數最大值-最小值）／4個大方格所數白細胞平均數評價標準：白細胞≤4×109/L時，RCS＜0.3白細胞=（4.1～14.9）×109/L時，RCS＜0.2白細胞≥15×109/L時，RCS＜0.15超過上述標準爲不合格。
4儀器誤差
計數板的鑑定要求計數板的檯面光滑、透明，畫線清晰，計數池畫線面積準確，必要時採用嚴格校正的目鏡測微計測量計數池的邊長與底面積，用微米千分尺測量計數池的深度。美國國家標準局（NBS）規定每個大方格邊長的誤差應小於1%，即1±0.01mm，深度誤差應小於2%，即0.1±0.002mm。若超過上述標準，應棄之不用。蓋玻片的標準蓋玻片應平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點測量（至少在9個點），不均勻度在0.002mm之內，必要時採用平面平行儀進行測量與評價，要求呈現密集平行的直線干涉條紋。最簡單的評價方法是將潔淨的蓋片緊貼於乾燥的平面玻璃上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉，表示蓋片平整、厚薄均勻。同時，合格的蓋片放置在計數池表面後，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋片與其他蓋片緊密重合後，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋片質量也達標。如果蓋玻片不達標勢必會影響實驗結果的準確性。
5其他情況
白細胞總數過低計數完成後，白細胞總數過低者（＜3×109/L），可擴大計數區域或重新加倍取血計數。白細胞總數過高對於白細胞總數過高者（＞15×109/L），可增加稀釋倍數重新計數，如若是外周血中有核紅細胞過多，必須再進行白細胞分類計數，然後用校正公式予以校正除去。校正公式[1]：白細胞總數=校正前白細胞數×［100/（100+100個白細胞中的有核紅細胞數）］
以上所述大致涵蓋了學生在白細胞計數實驗中容易出現的問題，若能有效克服,必定會大大增強實驗結果的可靠性。另外，熟能生巧，該項實驗初次完成後，建議再利用一些課時進行白細胞計數實驗的技能考試，強化規範操作，爲日後進行紅細胞計數及血小板計數等實驗打下良好基礎。
參考文獻
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[6]楊必清,番雲華,李軼勳.血液細胞分析顯微鏡復片的必要性探討[J].中國民康醫學,2014(18):17-18.
