【摘要】 目的 研究調亡抑制蛋白clusterin和survivin在大腸癌組織和相應癌旁組織中的表達情況及意義。 方法 應用免疫組織化學法檢測100例大腸癌癌組織和相應的癌旁正常組織的clusterin和survivin的表達情況，並進行相關的分析。 結果 clusterin在大腸癌組織中其陽性率爲67.0%，癌旁正常組織爲18.0%，兩者差異十分顯著(p< 0.01)；survivin在大腸癌組織中其陽性率爲58％，癌旁正常組織爲3％，兩者差異十分顯著(p < 0.01)；clusterin和survivin在大腸癌中的表達具有一定的相關性（r=0.225,p<0.01）。 結論 clusterin和survivin在大腸癌組織中具有較高的表達率在大腸癌中的表達呈正相關性，表明可能是大腸癌的生存基因，這爲大腸癌的基因治療提供了新的途徑。
【關鍵詞】 clusterin； survivin；大腸癌；基因治療
the expression and significance of clusterin and survivin in colorectoal carcinoma patients.
chen jin-yuan, li jie, xu hong.
( affiliated hospital of guangdong medical college, zhanjiang 514043, guangdong, p. r. china )
abstract: objective to investigate the relationship between the expression of clusterin and survivin in colorectal carcinoma patietns and its significance. methods immunohistochemical technique was used to detect the expression of clusterin and survivin in tissues of 100 colorectal carcinoma patients and adjacent normal tissues of 100 colorectal carcinoma patients . their relationship and significance were investigated. results the positive rates of clusterin in colorectal cancer and adjacent normal tissues of colorectal carcinoma patients were 67.0% and 18.0% respectively; the positive rates for survivin were 58 ％ tissues of colorectoal carcinoma and 3％ in the adjacent tissues, respectively; there was a positive relationship between the positive expression of clusterin and survivin in colorectal cancer lusions the positive expression rates of clusterin and survivin in colorectal carcinoma patients were higher than adjacent normal tissues of colorectal carcinoma; apoptosis of colorectal cancer was decreased by mutiple ways. the abnormal expression of clusterin and survivin showed that clusterin and survivin are survival gene of colorectal carcinoma patients.
key words: clusterin ; survivin； colorectal carcinoma; gene therapy
調亡的調節對人體組織保持內環境穩態及正常細胞形態至關重要，這一過程受到干擾將使細胞的壽命無限延長或積累突變，有利於腫瘤的發生。urvivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, iap)家族成員之一，是目前研究得比較多的一種抗調亡基因，survivin在胎盤和胚胎組織中高水平表達，在正常組織中不表達，已經證實survivin在許多腫瘤中過度表達[1，2]，但survivin在大腸癌中的作用所知甚少。clusterin是新近發現的一種重要的凋亡抑制因子，分子量爲75kda～80kda，基因定位於8q21，含有大約1651個鹼基，編碼由448個氨基酸組成的蛋白質。clusierin蛋白具有許多特徵性的結構域，自然狀態下人clusterin蛋白由分子量均爲40 000的兩個亞單位組成異源二聚體，具有典型的信號肽結構，包含一個α亞單位和β亞單位。它普遍存在於人體組織細胞的胞漿蛋白，具有多種生物學功能，主要有脂質轉運、輔助生殖、抑制補體介導的細胞免疫等。本實驗通過檢測clusterin和survivin在大腸癌中的表達研究其在大腸癌發生發展過程中的作用和大腸癌中clusterin和survivin表達的相關性，並探討靶向clusterin和survivin治療在大腸癌中的應用前景。
1 材料和方法
1.1 材料 收集廣東醫學院附屬醫院（2006，07~2007，07）來手術切除的大腸癌標本100例，所有標本均經病理學檢查確診。分別取腫瘤組織和癌旁正常組織（距腫瘤邊緣5cm，病理學證實爲正常組織）。每例標本切下後15min內冰下采集，置於-70℃冰箱保存。所有病例術前均未行化療、放療，有完整的臨牀資料與隨訪資料。其中男性62例，女性38例。年齡28－77歲，中位年齡59歲。結腸癌57例，直腸癌43例。病理類型：管狀腺癌57例，乳頭狀腺癌29例，粘液腺癌14例。duck,s分期：a期5例，b期38例，c期34例，d期23例。鼠抗人clusterin單克隆抗體工作液(克隆號：41d)（編號：zm-0285），兔抗人survivin多克隆抗體工作液（編號za-0458），sp試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。
1.2方法 用pbs代替一抗作爲陰性對照,用試劑贈送的陽性片作爲陽性對照。免疫組化染色前均染色複查病理類型。
1.3 結果判定 每一批免疫組織化學檢測標本均設有已知的陽性對照和用pbs代替一抗的空白對照。（1）survivin主要定位於細胞質，有棕黃色顆粒沉着。光學顯微鏡下隨機記測10個高倍視野中陽性細胞百分比：陽性細胞＜10％爲－，10％－29％爲＋，30％－59％爲＋＋，60％以上爲＋＋＋。（2）clusterin陽性細胞見於細胞質顯示棕黃色或棕褐色。光學顯微鏡下隨機記測10個高倍視野中陽性細胞數。
1.4 統計學處理 應用spss 13.0統計軟件進行相關分析。實驗結果用±s表示，兩因素間的差異比較採用x2檢驗，相關分析採用spearman相關係數，檢驗水平爲α=0.05，p＞0.05表示差異無統計學意義，p＜0.05表示差異有統計學意義，p＜0.01表示差異有明顯統計學意義。
2 結果
2.1 survivin在大腸癌中的表達以及與臨牀病理特徵之間的關係 survivin陽性染色主要定位於細胞質中，在大腸癌組織中的陽性率爲58/100（58.0%），而癌旁正常組織中的陽性表達率爲3/100（3.0%），兩者差異十分顯著(p<0.01)。survivin的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織類型之間均無明顯關係，而與分化程度、臨牀分期和淋巴結轉移之間有顯著關係，見表1。
表1 survivin蛋白表達與大腸癌臨牀病理特徵之間的關係（略）
2.2 clusterin蛋白表達與大腸癌臨牀病理特徵之間的關係 clusterin陽性染色主要定位於細胞質中，在大腸癌組織中的陽性率爲67/100（67.0%），而癌旁正常組織中的陽性表達率爲18/100（18.0%），兩者差異十分顯著(p<0.01)。clusterin的表達與患者的年齡、性別、腫瘤大小和組織類型之間均無明顯關係，而與分化程度、臨牀分期和淋巴結轉移之間有顯著關係，見表2。
表2 clusterin蛋白表達與大腸癌臨牀病理特徵之間的關係（略）
2.3 clusterin和survivin表達的關係 大腸癌組織中clusterin和survivin表達共同陽性45例，共同陰性20例。clusterin表達陽性survivin表達陰性22例，clusterin表達陰性survivin表達陽性13例。統計學相關性分析表明，clusterin和survivin在大腸癌組織中的表達呈正相關（spearman相關係數rs=0.255，p<0.01，表3），即隨着大腸癌組織中clusterin的表達率增高，survivin也有高表達趨勢。
表3 clusterin、survivin在大腸癌中表達的相關性（略）
3 討論
多年來，人們一直以爲細胞增殖和分化的異常是腫瘤發病的主要癥結所在，然而隨着細胞凋亡的概念的引入，人們開始從細胞凋亡的角度來審視腫瘤的發生。凋亡的調節對人體組織保持內環境穩態及正常細胞形態至關重要，這一過程受到干擾將使細胞壽命無限延長或累積突變，有利於腫瘤的發生。由此認爲腫瘤不僅是細胞增殖和分化異常的疾病，同時也是凋亡異常的疾病[1]。細胞的凋亡過程受凋亡促進因子和凋亡抑制因子的共同調節[2]，因此, 凋亡抑制因子的過度表達必然影響人體的穩定, 在癌症的發生、發展中起重要作用。clusterin和survivin就是目前研究得比較多的凋亡抑制因子。
clusterin的功能包括調節細胞-細胞，細胞基質相互作用，參與脂類轉運，參與生殖，細胞溶解，內分泌，補體介導和凋亡。最早於1983年在羊睾丸組織中分離得到，隨後又發現該蛋白在人體的許多組織包括腦、心臟、腎臟、肝臟、肺臟、眼、乳腺、子宮、前列腺等器官中均有表達[2]。sharou等[3]人的研究認爲clusterin是一種“粘附”蛋白，它的抑制細胞程序性死亡機制可能是直接通過與ntf分子的相互作用使靶細胞無法獲得細胞因子。另一種可能是clusterin在tnf的受體水平發揮作用。第三種可能是clusterni與細胞表面分子(如鞘磷脂)相互作用，干涉tnf的.信號轉導。本研究結果證明大腸癌組織中clusterni表達水平明顯高於癌旁正常大腸組織，且clusterni的表達與分化程度、臨牀分期和淋巴結轉移之間有顯著關係（p<0.01）；本研究發現隨着腫瘤的進展，臨牀分期越晚，分化程度越低且伴淋巴結轉移則clusterni的表達水平也會逐漸增高，由此表明在大腸癌的惡變過程中，clusterni通過抗細胞凋亡作用參與了大腸癌發生、發展甚至轉移等的生物學行爲。
survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, iap)家族成員之一，被認爲是迄今爲止發現的最強的凋亡抑制因子,特異地表達於人和鼠的胚胎髮育組織以及多數人類腫瘤細胞，在正常成人組織的表達僅見於胸腺、睾丸和分泌期子宮內膜，它的主要作用是抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤細胞增殖[4]。此外，它還與腫瘤的化療藥物敏感性和預後有關。由於survivin表達的組織特異性及功能的多樣性，使其成爲腫瘤研究領域的一個新熱點。survivin的表達具有很強的細胞週期特性，在g2/m期表達明顯增強[5]。抑制細胞凋亡的體外實驗表明，survivin通過直接或間接干涉caspase的功能而抑制細胞凋亡。survivin直接作用於caspase，主要是抑制easpase-3、caspase-7的活性，阻斷細胞的凋亡過程。survivin也可通過p21間接抑制caspase，其機制是suvrivin與細胞週期調控因子cdk4形成survivin-cdk4複合體，使得p21從cdk4的複合體中釋放出來，p21進一步與線粒體caspase-3結合，抑制其活性，阻止細胞凋亡[6]。
本實驗結果表明大腸癌組織中的survivin表達水平明顯高於癌旁正常大腸組織，癌旁正常大腸組織中幾乎無陽性表達（3%）。隨着大腸癌的不斷進展，survivin的表達水平也逐漸升高，而高吳陽[7]也指出survivin的表達隨着腫瘤分級的增加、臨牀牀分期的增加而相應增加。
腫瘤的形成和發展是一個多因素、多階段以及長期相互作用的正常細胞惡性轉化的過程。本實驗發現clusterni與survivin在大腸癌組織中的表達呈正相關，clusetrin與survivin執行各自不同抗凋亡功能，這兩條途徑在抗凋亡作用上起協同作用，究其機制有待於進一步研究，是否二者表達受一個共同調控基因的影響尚不清楚。近50年來，儘管大腸癌的外科治療技術迅猛發展，但是我國大腸癌的手術治癒率、5年生存率始終徘徊在50%左右（歐美髮達國家爲60%~62%），治療失敗的主要原因爲局部複發率較高，越來越多的學者試圖從凋亡途徑來克服這個問題。
本研究發現作爲生存蛋白clusterni與survivin其與大腸癌的生物學行爲有密切的關係，可作爲大腸癌的聯合預後因子，而針對clusterin與survivin的靶向治療在許多腫瘤模型中已經被證實具有可行性。如果封閉clusterin和survivin基因或者降低其表達能夠介導細胞凋亡、抑制細胞增值，從而控制腫瘤生長，避免多藥耐藥以增加腫瘤細胞對化療的敏感性，克服腫瘤細胞的耐藥性，提高化療的緩解率，那麼clusterin和survivin就可以成爲大腸癌基因治療的新的生存基因。本實驗試圖通過探討clusterin和survivin的表達與大腸癌的關係，爲將來通過以clusterin和survivin爲靶點進行基因治療和臨牀新的抗腫瘤藥物的研發提供理論基礎，併爲大腸癌的治療提供新的解決途徑。目前對於clusterin和survivin在腫瘤中的抗凋亡機制是否有決定性意義以及其抗凋亡作用在腫瘤發生發展過程中的相互作用方式還不是很明確，有待於進一步研究。
【參考文獻】
［1］ evan g,littlewood nce,1998;281(5381):1317～1322.
［2］ trougakos ip，gonos es．clusterin／apolipoprotein j in human ageing and cancer［j］．in j biochem cell biol，2002；34(11)：1430~1448.
［3］ sharou m，joseph ss，janmes m，et toxic sensitivity to tumor necrosis factor-a1pha in pc3 and lncap prostatic cancer cells is regulated by extracellular leve1s of sgp-2(clusterin) ［j］tate，1999，39(2):87~93.
［4］ ambrosini g，adida c，altieri dc.a novel antiapoptosis gene，suvivin，expressed in cancer and lymphoma［j］re med，1997(8):917~921.
［5］ li f，altieri dc. the cancer antiapoptosis mouse survivin gene: charaeterization of locus and transcriptional requirements of basal and cell cycle-dependent expression.［j］ cancer res，1999,59，3143~3151.
［6］ suzukia，hot，kawano h，et ivin initiates proeaspase3/p21 complex formation as a result of interaetion with cdk4 to resist fas mediated cell death ［j］gene，2000，19(10):1346.
［7］ 高吳陽，胡傳義，易慕華ivin蛋白在前列腺癌中的表達及其與腫瘤細胞凋亡的關係［j］.中華男科學，2004，1:12~14.
